荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫体内的荧光素酶(FireflyLuciferase)。萤火虫荧光素酶属于加氧酶，其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
活体成像技术原理：
将荧光素酶编码序列通过递送工具递送至目的细胞或组织内表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予相应底物，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。
底物给药方式及特点：
常用的底物给药方式有腹腔注射和尾静脉注射。
腹腔注射（常用）：迅速分布全身，并穿过包括大脑在内的血液组织屏障；注射底物10～20分钟后，发光信号达到峰值；
尾静脉注射：可提供更好的再现性和5～10倍的高信号，但是注射难度较高，代谢快。
建议：第一次使用荧光素酶底物成像，或者更换新品牌底物，需要进行预实验，观察底物在何时达到峰值。确定注射荧光素底物和成像之间的最佳延迟，然后将此时间用于所有实验，以标准化成像数据。
常见问题
Q：荧光素酶的发光是否需要激发光？
A：荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素（Luciferin）。
Q：底物荧光素（Luciferin）是如何进入小鼠体内的？需要多少？
A：荧光素一般通过腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。大部分文献中，荧光素的浓度是mg/kg。20g的小鼠约需3mg的荧光素（具体可参考相应文献）。
Q：荧光素酶的发光特性如何？
A：通过腹腔注射老鼠后约一分钟左右荧光素酶就开始发光，通常十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点通常持续约20-30分钟后开始衰减，约三小时后发光全部消失。通常最好的检测时间是在注射后15-35分钟之间，建议实验人员在做不同实验模型前进行连续时间点发光曲线的绘制，以确定最高稳值的时间范围。
Q：有几种常用的荧光素酶？特性如何？
A：常用的荧光素酶有两种，分别是Luciferase和Renilla荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在-nm，后者所发的光波长在-nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。
Q：正常成年小鼠可以看到体内发光吗？是否需要裸鼠？
A：可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在于对可见光的穿透性不同。
Q：荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比？
A：是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点，包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。有文献显示荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9以上。
Q:动物的皮肤和毛发是否会影响收集光信号的强弱？
A:会有一定的影响。例如，C57BL/6小鼠毛发生长周期由三个阶段组成：静止期（皮肤为淡粉色）、生长期（皮肤变为深灰色或黑色）、成熟期（毛发停止生长，皮肤恢复为淡粉色）。生长期中的皮肤色素沉着是活体成像中的一个重要变量，特别是当需要对小信号变化或动物之间的信号差异进行评估时，强烈着色的皮肤可导致90%以上的光信号衰减，这是可能导致实验误差的因素之一。此外，就算是处于静止期或成熟期的小鼠，身上的毛发也会造成一个数量级的光信号衰减。建议：成像前一天，需要通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。