视网膜色素变性（retinitispigmentosa,RP）是一组以夜盲、视野缩小、眼底骨细胞样色素沉着和光感受器功能不良为特征的进行性遗传性眼病。细胞因子在其发病中发挥重要作用。研究发现，睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophicfactor，CNTF）可以防止视网膜感光细胞变性，促进视网膜神经节细胞存活，刺激神经节细胞轴突和视神经髓鞘的再生。但是，关于CNTF在RP组织内的表达及含量的变化目前尚没有相关的报道，本研究就此进行探讨，以期能对视网膜变性疾病的治疗有所参考。
1.材料和方法
1.1实验动物及其相关处理
取出生后刚满0~4周龄的C57BL小鼠（为正常对照组）和rd小鼠（为病变组，rd小鼠为遗传性视网膜变性小鼠）各9只处死后，即刻摘出眼球，放入ＥP管（事先装有包埋剂）内，－℃液氮冷冻，－80℃低温冰箱冻存；取出后用恒冷箱切片机（德国Leica公司）切成薄片，切片厚度为4μｍ；贴于载玻片，丙酮浸泡固定组织10min，取出冻存于－80℃低温冰箱内。
1.2亲和免疫组织化学染色技术
取待测切片干燥；
PH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）洗5min，共3次；
加3％H2O2－甲醇，室温20min；
PH7.2的PBS洗5min，共3次；
加正常血清，37℃，30min；
擦去多余血清，滴加一抗（兔抗鼠CNTF抗体，SantaCruz公司），置于4℃冰箱过夜；
PH7.2的PBS洗5min，共3次；
滴加桥抗体即二抗（兔SAPKit，SantaCruz公司），37℃，30min；
PH7.2的PBS洗5min，共3次；
滴加ABC复合物，37℃，45min；
PH7.2的PBS洗5min，共3次；
滴加Ｈ2Ｏ2－二氨基联苯胺（DAB）底物显色，室温3~10min；
流水冲洗；
苏木精复染细胞核；
乙醇上行脱水，二甲苯透明，树胶封固。
阳性产物为棕*色的沉淀。
1.3光学显微镜法
应用光学显微镜复合图像采集系统（OlymPusBX51，日本），对染色的切片在10倍，20倍或40倍下分别取若干视野摄片存盘。
1.4免疫组织化学图像定量分析方法
应用CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统（OlymPusBX50，日本），对染色的切片进行图像形态学半定量分析。在40倍显微镜物镜下，每张切片随机选择4个视野进行图像采集与存储，在进行阳性目标的彩色分割后，图像分析系统自动计算每个视野中形态学阳性目标的积分光密度（OPTDM）。OPTDM值越大，代表待测组织内阳性目标个数越多，阳性染色程度越强。
1.5统计学方法
采用两种统计学原理。
首先，是横向对比（相同周龄不同种属间进行对比），采用两独立样本比较t检验，即针对出生后第0~4周龄各时间点分别作独立t检验，得出P值（在出生后第1周龄因病变组数值非正态，转行秩和检验），由此得出，生长时间相同的条件下，病变与否对视网膜内CNTF表达的影响。
其次，是纵向对比（相同种属不同周龄进行对比），采用5个样本比较的单因素方差分析，即针对2组小鼠分别作5个样本比较的单因素方差分析，得出病变组和对照组各自方差分析的P值，由此得出，小鼠种属相同的条件下，年龄的增长对视网膜内CNTF表达的影响；其中，在对照组（C57BL小鼠）组内进行方差分析时，各周龄数值均符合正态，总体方差不齐，取对数转换后P＝0.，具有齐性，对新变量作单因素方差分析，得P＝0.＜0.05，总体有意义，作两两比较，检验标准α＝0.05；在病变组（rd小鼠）组内进行方差分析时，因出生后第1周龄的数值非正态，转行"5个独立样本的秩和检验"，得P＝0.，取双侧检验标准α＝0.05，总体无意义。
2.结果
2.1免疫组织化学染色
2.1.1CNTF在正常对照组（C57BL小鼠）的染色结果
出生后第0周龄时，视网膜除内丛状层（innerplexiformlayer，IPL）和节细胞层（ganglioncelllayer，GCL）外，其他核层尚未分出；CNTF主要在近视网膜色素上皮（RPE）区着染，在IPL和GCL也清晰着染。
出生后第1周龄时，视网膜的内外核层开始分层，但核层分界不明显，感光细胞的内外节段尚未形成；CNTF在视网膜近RPE区，IPL和GCL着染，且其阳染程度较出生后第0周龄时更深。
出生后第2周龄时，视网膜的10层结构已分化完整，尤其可见已形成的内外节段；CNTF主要在内核层（INL）、IPL、外丛状层（OPL）和GCL以及感光细胞的内节段（IS）着染，其阳染程度较出生后第1周龄时略浅。
出生后第3周龄时，视网膜的结构继续分化良好；CNTF着染区域同前，而阳染程度较出生后第2周龄时又明显增强，尤其可见感光细胞的IS呈清晰棕*色条带状。
出生后第4周龄时，视网膜的10层结构维持良好；CNTF仍旧在INL、IPL、OPL和GCL以及感光细胞的IS着染，但程度较出生后第3周龄有所下降。
2.1.2CNTF在病变组（rd小鼠）的染色结果
出生后第0周龄时，除IPL和GCL外，其他核层尚未分出；CNTF主要在近RPE区着染，在IPL和GCL也轻微着染，阳性染色程度均明显低于同期正常对照组。
出生后第1周龄时，视网膜的内外核层开始分层，但核层分界不明显，感光细胞的内外节段尚不清楚，与对照组相比，细胞排列稍有紊乱；CNTF在视网膜近RPE区，IPL和GCL轻微着染，与同期正常对照组相比染色更淡。
出生后第2周龄时，视网膜组织分层明显，初步形成视网膜10层结构，细胞排列更紊乱；CNTF在视网膜近RPE区，IPL和GCL继续保持淡染。
出生后第3周龄时，小鼠视网膜的内外核层迅速退变1层，视网膜的厚度明显变薄，约减至出生后第2周龄时厚度的一半；CNTF在视网膜近RPE区，IPL和GCL继续保持淡染。
出生后第4周龄时，视网膜神经细胞的数量继续减少，分布更为稀疏；CNTF在视网膜近RPE区，IPL和GCL继续保持淡染。
2.2CNTF的半定量分析
在每种动物出生后各时间点，均随机选取６张视网膜切片，在每张切片上再随机选取4个视野进行半定量分析，由此，在病变组和对照组的各周龄均产生24个积分吸光度值。对各组数据经过正态检验和方差齐性检验后，分别进行统计学检验。
2.2.1相同周龄不同种属间的比较结果
针对出生后第0~4周龄各时间点分别作独立ｔ检验（在出生后第1周龄因病变组数值非正态，转行秩和检验）的P值（表1）。
总起来看，出生后第0~4周龄的每个时间点，2种小鼠视网膜内的CNTF表达量的差异分析所得P均＜0.05，故出生后第0~4周龄的5个时间点，2种小鼠视网膜内CNTF表达量的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
2.2.2相同种属不同周龄间的比较结果
针对2组小鼠分别作单因素方差分析，①对照组（C57BL）组内的分析结果：各周龄数值均符合正态，总体方差不齐，取对数转换后P＝0.，具有齐性。对新变量作单因素方差分析，得P＜0.01，总体有意义。作两两比较，检验标准α＝0.05（表2）。
②病变组（rd小鼠）组内的分析结果：因出生后第1周龄的数值非正态，转行"5个独立样本的秩和检验"，得P＝0.，总体无意义。
2.2.3不同种属不同周龄间的综合比较结果
在出生后第0~4周龄的这5个时间点，病变组小鼠视网膜内CNTF的含量均明显低于同期对照组的含量，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。2组各自的CNTF含量在4周内的变化曲线的特点不同：病变组的CNTF含量呈持续缓慢增高的趋势，但总体始终处于较低的水平；而正常对照组的CNTF含量为"先升高→再降低→二次升高→二次降低"的趋势，2次含量的高点分别在出生后第1周龄时和出生后第3周龄时。
3.讨论
CNTF是Adler等在年发现，因其可维持睫状神经元纤维生存而得名。CNTF为一种酸性蛋白，相对分子质量为20~40，其结构与白细胞介素（IL）－６有一定相似性，不同之处在于CNTF无疏水的引导序列。一般认为，细胞内合成的CNTF不能分泌到细胞外。人类CNTF基因位于染色体11ｑ12。CNTF在外周神经分布广泛。目前CNTF在视网膜方面的研究，主要有一下几方面的观点。
3.1就作用效果而言
大多数研究者认为：
①CNTF对RGC有防止退变和损伤的效应：Johnson等体外培养观察Th1-YAP小鼠RGC树突退变过程，发现加入CNTF和脑源性神经营养因子（BDNF）的培养液中RGC树突变性较对照组有明显减弱；Wang等在光化学诱导鼠后部缺血性视神经损伤实验中发现，加入碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）和CNTF后可以显著减少RGC损害，损伤后3周时至少有40％的RGC存留（对照组损伤后3周时呈70％RGC损失）。
②CNTF能促进感光细胞存活、诱导再生、防止变性的作用。Jankowiak等在NCLF小鼠（一种溶酶体贮存紊乱神经元退变的神经元蜡样脂褐质症小鼠）眼内植入CNTF缓释－神经干细胞体观察4~６周后存活的感光细胞数量明显较对照组（仅植入神经干细胞体）增多；Wen等研究认为CNTF可诱导锥细胞外节段再生；Jung等将经多顺反子慢病毒介导的分泌CNTF型神经干细胞由玻璃体腔注入后，发现其黏附于晶状体和视网膜上，分泌大量CNTF，对rd1／rd10（2种视网膜色素变性小鼠）的感光细胞变性均有明显的减弱效应。
③CNTF对视网膜细胞损伤有防护效应。Barone等发现环境强化法可以增加CNTFｍＲＮＡ的表达，进而对rd10小鼠的视网膜的形态、生理功能和视觉起显著的保护效应。
④CNTF可以影响*斑厚度。Pilli等发现在RP患者玻璃体腔内注入CNTF后，*斑平均厚度变化呈现个体剂量依赖式反应，在高剂量注射时*斑厚度较基线增加明显，而且*斑区视网膜呈均匀增厚。
⑤对视神经髓鞘有保护效应。Satarian等将人类诱导多能干细胞分泌的定向神经前体细胞植入视神经损伤的鼠玻璃体腔，引起CNTF、BFGF分泌，使得RGC和轴突数量明显增多，通过荧光示踪显示神经轴突和髓鞘均有所保护。
⑥CNTF有助于视力和视敏感度提高。Ｌｕ等在ＲCＳ大鼠视网膜下或玻璃体腔内植入人类胚胎干细胞源性小分子，使植入去视网膜Miller细胞表达CNTF增强，对感光细胞及视功能均有明显的保护效应，实验组较对照组的视力和视敏感度均明显提高。
但少数研究者认为，CNTF对视网膜神经细胞的变性或损伤无保护效应。其中，Ortin-Martinez等在光诱导视锥细胞、视杆细胞损伤的对照试验研究中发现，CNTF对L型及S型锥细胞没有明显的保护效应。Zein等将CNTF缓释球囊植入人类全色盲患者眼球内发现并没有提供视锥细胞功能，这点与CNTF对犬类的作用有所不同。
3.2就作用机制而言
①Lipinski等在对视网膜变性鼠进行长效CNTF保护实验中，通过转录组序列分析发现，CNTF调节神经保护的机制是通过广泛上调蛋白水解酶抑制剂的水平而实现，后者可以组织神经变性疾病中细胞及细胞外基质的降解和补体的激活。
②Rhee等研究认为，外源性CNTF是通过作用于Muller细胞，诱导后者产生细胞因子并与细胞因子受体结合，从而促进感光细胞存活。
本研究发现，就生长发育而言，在正常小鼠视网膜组织，出生后第2周龄时初步形成视网膜10层结构，出生后3周龄时视网膜具备典型的10层结构；而在视网膜变性小鼠视网膜组织，出生后第2周龄时也初步形成视网膜10层结构，而出生后第3周龄时视网膜的内外核层迅速退变。就分布而言，正常视网膜组织内的CNTF主要在GCL、IPL、INL、OPL和感光细胞的IS着染；而变性视网膜组织内的CNTF仅在GCL淡染。就CNTF的表达而言，正常视网膜组织在出生后第1~4周龄时持续高表达，而变性视网膜组织仅在出生后第3~4周龄时相对高表达，且表达量仍明显低于正常对照组。
研究结果提示，出生后第1~2周龄是小鼠视网膜发育至基本成形的重要阶段，CNTF含量的不足可能参与导致rd小鼠视网膜神经细胞的发育和分化的不完善。在视网膜变性的治疗探索中，如果能发现并抓住视网膜发育的关键阶段（早期），给予足够量的外源性CNTF的持续补充或在适当的程度上刺激其内源性CNTF的持续增多，可能会对视网膜的良性发育起到一定的保护作用；其次，在视网膜形态的维持阶段（晚期），可能在一定程度上也需要以外源性给予或内源性刺激的方式来维持视网膜内CNTF含量达到足够的水平。
专家介绍李根林
医院眼科中心眼底病科主任医师，教授，博士研究生导师
从事眼底病专业20余年，发表论著余篇。对各种类型眼底病的诊治具有丰富经验，特别是对于各种类型视网膜变性的遗传咨询和临床治疗具有独到之处，是国内视网膜色素变性治疗领域的著名专家。具有丰富的眼底激光手术经验，尤其擅长对各种类型视网膜血管疾病和*斑变性等病变的激光治疗。对眼底疾病的药物治疗具有独到之处。
来源：《山西医药杂志》年3月第46卷第5期郑浩，李根林
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