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今天推荐的是由中国上海交通大学医学院在年6月26日发表于FrontiersinCellandDevelopmentalBiology（IF：6.，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是QingfengLi教授，研究表明USP15在皮肤伤口修复过程中通过去泛素化EIF4A1增强再上皮化。研究背景
再上皮化是伤口愈合的基本过程，涉及皮肤屏障重建过程中的各种细胞因子和细胞。泛素特异性肽酶15(USP15)是去泛素化酶(DUB)的重要成员，可从靶蛋白中去除泛素链并保持蛋白质稳定性。然而，USP15在上皮形成中的动态作用仍不清楚。摘要部分
作者旨在研究USP15在再上皮化中的调节功能。建立切除伤口夹板模型以评估USP15敲除(KO)小鼠的再上皮化率。进行共免疫沉淀(Co-IP)和质谱分析以鉴定USP15相互作用蛋白。对角质形成细胞中的转录组分析进行RNA测序并上传到NODE数据库。首先，在USP15KO小鼠中观察到上皮化的显着延迟。此外，在USP15沉默的角质形成细胞(HaCaTs)中观察到细胞迁移和增殖的抑制。作者首次揭示USP15可以与真核起始因子4A-1(EIF4A1)相互作用，从而促进角质形成细胞的翻译效率，这对角质形成细胞的增殖和迁移至关重要。最后，USP15-EIF4A1复合物显着加速了伤口愈合中的再上皮化。这些观察结果有助于阐明USP15在调节伤口愈合过程中再上皮化的功能和机制，为难治性伤口治疗提供了一个新的靶标。研究内容
1.Usp15基因敲除小鼠的延迟再上皮化现象首先，作者测试了USP15在人类皮肤组织的全层中的表达。IF和IHC均显示USP15蛋白信号在角质形成细胞中富集，而其他细胞呈现低USP15表达（图1A,B）。此外，作者的研究中使用了USP15基因敲除小鼠。作者证实，在USP15敲除小鼠中，角质形成细胞中的USP15蛋白表达确实被沉默（图1C,D）。随后作者建立了一个切除伤口夹板模型，并观察到Usp15基因敲除小鼠的再上皮化显着延迟（图1E,F）。在伤口愈合过程中，缝隙会被角质形成细胞的增殖和迁移而闭合。此外，作者研究发现USP15敲除小鼠中伤口模型的上皮间隙显着增加（图1G）。
图1.USP15–/–小鼠的再上皮化被延迟
研究结论：Usp15基因敲除小鼠的延迟再上皮化现象。2.USP15的缺失减弱了角质形成细胞的增殖和迁移作者接下来探究了USP15在角质形成细胞中的调节功能。在用shUSP15和阴性对照shNC的短发夹序列转染慢病毒后，作者在转染后观察到USP15的mRNA和蛋白质表达显着降低。Transwell测定表明，在抑制USP15后，通过8毫米孔转移的上层细胞减少（图2A,B）。伤口愈合试验显示USP15沉默组的伤口恢复率显着延迟（图2C,D）。此外，与对照组相比，USP15敲低组中的细胞也形成了更少和更小的集落（图2E）。CCK-8试验证明USP15抑制细胞的细胞增殖率受到抑制（图2F）。流式细胞术检测显示抑制USP15表达后S期细胞百分比降低（图2G）。不仅如此，与对照组相比，抑制USP15后S噬菌体百分比下降且G0/G1期百分比增加。更重要的是，与野生型组相比，Usp15KO皮肤组织的再生角质形成细胞的Ki67阳性率降低（图2H）。
图2.USP15的缺失抑制了体外增殖和迁移
研究结论：USP15在体外或体内角质形成细胞的增殖和迁移中至关重要。3.USP15沉默细胞中的转录组分析为了进一步探索USP15在角质形成细胞中调控作用的详细机制，作者在USP15抑制后进行了转录筛选。RNA-seq分析表明USP15沉默导致HaCaT细胞中个基因的上调和个基因的下调（图3A）。基因本体（GO）分析和Circos图显示主要差异表达基因与表皮过程相关，如角质化、皮肤表皮发育和角质形成细胞分化（图3B），而上调基因主要与转录调控相关。京都基因和KEGG分析表明，最高上调的途径与免疫和致癌作用的调节有关（图3C），而下调的途径与感染和代谢调节有关。此外，通过基因集富集分析(GSEA)，作者发现抑制USP15后翻译相关过程显着下调（图3D）。
图3.USP15沉默细胞中的转录分析
研究结论：USP15沉默细胞中的转录组分析显示，USP15抑制后主要差异表达基因与表皮过程、转录调控、感染代谢、免疫和致癌作用相关。4.USP15与EIF4A1相互作用为了探究USP15在翻译调节中的详细机制，作者进行了免疫共沉淀，并通过银染鉴定了裂解物（图4A）。质谱分析鉴定了18种可以特异性结合USP15的蛋白质（图4B）。使用抗USP15在质谱中鉴定了这些蛋白质。GO分析显示这些特异性结合蛋白主要分布在核糖体中（图4C）。此外，通过蛋白质相互作用网络，作者发现EIF4A1可能在USP15引导的翻译调节中发挥核心作用（图4D）。此外，蛋白质印迹分析证明USP15蛋白可以在抗EIF4A1组中被拉下，这表明EIF4A1和USP15之间存在直接相互作用（图4E）。此外，在使USP15沉默后，总蛋白USP15已大大减少（图4F），且识别出较弱的相互作用信号（图4F）。
图4.USP15的相互作用分析
研究结论：USP15与EIF4A1能够发生相互作用。5.USP15去泛素化EIF4A1并增强其体外和体内稳定性由于USP15可以与EIF4A1相互作用，作者随后研究了EIF4A1表达是否可以受USP15调节。作者发现EIF4A1的mRNA水平在USP15沉默后保持不变（图5A）。然而，在敲除USP15后观察到EIF4A1蛋白水平显着降低（图5B）。这些结果表明USP15可以在转录后水平上增强EIF4A1的表达。由于USP15是DUB，作者在沉默USP15后测试了EIF4A1的泛素化水平。正如预期的那样，EIF4A1的泛素化水平在抑制USP15后显着上调（图5C）。然后作者在HaCaT细胞中过表达USP15。作者观察到USP15表达在mRNA和蛋白质（图5D）水平上均显着增加。此外，作者观察到EIF4A1蛋白表达显着上调（图5D），而EIF4A1的RNA表达保持不变，这表明USP15可以与EIF4A1相互作用并使其去泛素化，从而促进EIF4A1蛋白稳定性。此外，在USP15-/-小鼠中观察到EIF4A1的微弱荧光信号，表明USP15还可以促进体内EIF4A1蛋白的稳定性（图5E）。
图5.USP15去泛素化EIF4A1
研究结论：USP15去泛素化EIF4A1并增强其体外和体内稳定性。6.EIF4A1促进角质形成细胞的增殖、迁移和翻译EIF4A1是翻译起始的关键因素；然而，EIF4A1在角质形成细胞中的作用仍不清楚。因此，作者在HaCaT细胞中用siRNA抑制了EIF4A1的表达（图6A）。此外，EIF4A1蛋白水平在沉默EIF4A1后显着下调（图6B）。与对照细胞相比，EIF4A1沉默的细胞呈现出较慢的增殖率并形成更小的集落（图6C,D）。另一方面，伤口愈合试验和Transwell试验都表明，敲除EIF4A1后细胞迁移显着减弱（图6E-G）。
图6.EIF4A1促进了角质细胞的生长和迁移
作者随后进行了转录组分析并证明在使EIF4A1沉默后有个上调基因和个下调基因（图7A）。这些改变的基因主要参与细胞饥饿、细胞骨架/肌动蛋白重塑和缺口信号通路（图7B）。此外，在干扰EIF4A1后观察到翻译过程的显着减少，这表明EIF4A1在翻译中的重要作用（图7C）。
图7.EIF4A1沉默的细胞的转录分析
研究结论：EIF4A1促进角质形成细胞的增殖、迁移和翻译。
结论与讨论
Thankyou!
往期链接1.乳腺癌中USP1通过泛素化修饰调控TAZ蛋白的稳定性2.想发高分文章？或许可以试下这个研究思路，赶紧学习下3.USP1靶向ULK1并调节其细胞区室化和自噬4.去泛素酶USP1的抑制使KPNA2不稳定并抑制乳腺癌转移5.β-catenin的异常激活可通过USP1稳定EZH2驱动神经胶质瘤的发生6.综合分析USP1在肝癌中的重要作用7.FANCI和FANCD2不同的泛素化功能使ID2-DNA稳定结合8.Rheb泛素化调控生长因子诱导的mTORC1激活9.FA蛋白FANCI在核糖体的生物合成中发挥作用10.ATR介导的FANCI磷酸化同时调控FANCD2的泛素化和去泛素化11.USP1通过去泛素化Akt抑制长期饥饿时肌肉中的PI3K-Akt-Foxo信号转导12.USP2通过拮抗E3-泛素连接酶IDOL调控LDLR信号通路预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇